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    真菌毒素檢測(cè)技術(shù)與產(chǎn)品服務(wù)（1）

    發(fā)布時(shí)間： 2009/3/27　　點(diǎn)擊次數(shù)： 2643次
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    相關(guān)產(chǎn)品：
    詳細(xì)介紹：

     液相色譜法測(cè)定谷物中赭曲霉毒素含量

     
    摘要：研究了液相色譜法測(cè)定谷物中赭曲霉毒素的方法。樣品經(jīng)乙腈水（84：16）提取，提取液通過(guò)PuriToxSR 130赭曲霉毒素凈化柱凈化、濃縮，C18色譜柱分離，熒光檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法定量。對(duì)添加兩個(gè)濃度赭曲霉毒素的玉米樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，平均回收率為99.12%和103.09%，變異系數(shù)分別為0.281%、1.214%，zui低檢測(cè)限為0.20ng/kg，方法簡(jiǎn)便易行，準(zhǔn)確精密度高，值得推廣。
     
    Abstract: HPLC is applied to the determination of ochratoxin A in grains .The sample is extracted with 84/16 acetonitrile/water. Filtrace is cleaned up by ochratoxin purification column. Fluorescent ochratoxin A is separated on NovapakC18 column,and is detected by fluorescent detector and is quantified by external standard. Corn samples are fortified with    ochratoxin A at the twe levels. Five replicate analysis are performed each level. The recoveries of ochratoxin A are 99.30%~103.09%.The variation coefficients are 0.281%~1.214%.The detection limit is 0.20ng/kg. The precision and accuracy of this method are   satisfactory.
     
    霉菌遍布世界各地，種類(lèi)繁多，依生活習(xí)性，分為倉(cāng)儲(chǔ)霉菌和田間霉菌。赭曲霉毒素（簡(jiǎn)稱(chēng)OTA）是溫暖地區(qū)zui重要的倉(cāng)儲(chǔ)毒素，廣泛存在于玉米、大麥、小麥和飼料中,麩皮的污染高于整粒谷物。在熱帶和亞熱帶地區(qū)主要由曲霉菌產(chǎn)生，而溫暖地區(qū)則由青霉屬產(chǎn)生。廣東地處亞熱帶，溫濕度十分適宜霉菌的生長(zhǎng)，據(jù)有關(guān)調(diào)查該毒素污染在飼料原料和配合飼料中普遍存在，陽(yáng)性率大于60%2。赭曲霉毒素危害很大，據(jù)報(bào)道，每千克飼料中含有0.2-0.3克，就可使雞中毒，zui常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)有：鈣磷吸收障礙，骨骼脆弱，蛋殼鈣化不全，破蛋率高，皮下出血，容易挫傷。對(duì)家畜主要攻擊腎臟、免疫系統(tǒng)和造血系統(tǒng)，肝臟變得脆弱，劇渴，生長(zhǎng)遲緩，多尿、下痢、糖尿癥。癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）已證明OTA對(duì)人可能是致癌的。有建議指出OTA引起地方腎病和膀胱腫瘤。但 FAO/WHO專(zhuān)家協(xié)會(huì)指出，以上這些結(jié)論證據(jù)不足，其他的腎毒性可能起著重要作用（WHO2002）。一些國(guó)家已經(jīng)制定*，歐盟對(duì)麥片的*是5ug/ml3.根據(jù)中國(guó)國(guó)家有關(guān)規(guī)定，玉米中赭曲霉毒素的zui高*為：20ug/kg.
    現(xiàn)常用的檢測(cè)方法多為薄層色譜和酶聯(lián)免疫法，薄層色譜法操作繁瑣，污染大、定量差，耗時(shí)長(zhǎng)，而酶聯(lián)免疫法雖操作簡(jiǎn)單，但存在假陽(yáng)性，準(zhǔn)確性欠佳，此液相色譜法操作簡(jiǎn)便，快速，準(zhǔn)確靈敏度高，不失為一種好方法。
    1.實(shí)驗(yàn)部分：
    1.1試劑和儀器
    乙 腈（色譜純）  冰醋酸（分析純） 去離子水
    赭曲霉標(biāo)準(zhǔn)液：10ug/ml 溶劑為乙腈
    PuriToxSR 130赭曲霉毒素凈化柱
    Waters2695液相色譜儀
    熒光檢測(cè)器
    1.2步驟
    1.2.1  取樣：取代表樣品5kg，粉碎，充分混合均勻，四分法縮至500g, 因霉菌毒素分布不均勻，充分混合非常重要，必要時(shí)取樣量加大，有地方建議取15kg。
    1.2.2  提?。喝?5g粉碎樣品于250ml三角燒瓶?jī)?nèi)，加100ml乙腈水（84：16），在振蕩器上振蕩1小時(shí)，用定量濾紙過(guò)濾。
    1.2.3  標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)備：將50ul 10ug/ml 的赭曲霉毒素在一個(gè)棕色瓶子里吹干，用10ml的流動(dòng)相進(jìn)行溶解，渦旋1分鐘，此為50ng/ml的赭曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)液；另將1 ml10ug/ml
    的赭曲霉毒素在一棕色瓶子內(nèi)吹干，用10ml的流動(dòng)相溶解，渦旋1分鐘，此為1ug/ml的赭曲霉加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液。
    1.2.4   凈化濃縮：取7ml的樣品提取液進(jìn)一玻璃試管內(nèi)（與前處理柱配套提供）
    （加標(biāo)時(shí)取7ml的空白樣品分別加10ul和35ul的1ug/ml的赭曲霉標(biāo)準(zhǔn)溶液）,加70ul的冰已酸，混合，用PuriToxSR 130赭曲霉毒素凈化柱凈化萃取液,然后將凈化液，轉(zhuǎn)移4ml的凈化液到另一試管，60℃水浴中氮?dú)獯蹈桑?/span>400ul的流動(dòng)相（60/40/1水/乙腈/乙酸）溶解，渦旋30min ，轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管內(nèi)10000rpm離心5分鐘，轉(zhuǎn)移350ul 的清潔樣品進(jìn)入液相。
     
    1. 3儀器條件
     
    Waters2695液相色譜儀，2475熒光檢測(cè)器
    色譜柱：NovapakC18（5um） 3.90*150mm   Waters PAHC18（5um）4.6*150mm
    流動(dòng)相：60/40  水/乙腈
    流速：0.5ml/min  運(yùn)行時(shí)間：20min
    柱溫：40℃
    進(jìn)樣體積：60ul
    EX:330nm      EM:460nm
     
    2. 0測(cè)定結(jié)果
     
    2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程：取制定好的50ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用流動(dòng)相分別稀釋成1、2、5、10、20、30、50ng/ml的濃度，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。
     
    表1.   標(biāo)準(zhǔn)曲線的基本參數(shù)：

    濃度范圍
    1.0
    2.0
    5.0
    10.0
    20.0
    30.0
    50.0
    峰面積
    103454.993
    210799.985
    515389.964
    1064099.926
    2285364.840
    3442139..760
    5463738.891
    相關(guān)系數(shù)
    0.9995
    回歸方程
    Y=1.11×105X-1.85×103
    檢測(cè)限
    0.20ng/kg（按3倍信噪比計(jì)算）

     
     
     
    2.2不同濃度添加回收實(shí)驗(yàn)：取玉米樣品1份，分別做兩個(gè)濃度的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。
    表2.兩個(gè)濃度的樣品添加回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果表：

    組分
    本底值
    添加標(biāo)準(zhǔn)液的體積
    10ul
    35ul
    赭曲霉毒素
    0
    添加處理后理論濃度
    14.28ng/ml
    50.0ng/ml
    添加次數(shù)
    1
    2
    3
    4
    5
    1
    2
    3
    4
    5
    添加后測(cè)得濃度（ng/ml）
    14.18
    14.16
    14.13
    14.20
    14.10
    52.06
    52.16
    51.13
    51.68
    50.69
    回收率
    99.30
    99.16
    98.95
    99.44
    98.74
    104.12
    104.32
    102.26
    103.36
    101.38
    平均值
    99.12
    103.09
    RSD（%）
     
    0.281
     
    1.214

     
    2.3精密度實(shí)驗(yàn)：選擇不同含量的玉米樣品兩份，分別平行測(cè)定8次，結(jié)果見(jiàn)表3
     
    表3.精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    檢測(cè)次數(shù)
    1
    2
    3
    4
    5
    6
    7
    8
    平均值
    RSD
    樣品1測(cè)定值
    11.23
    11.46
    11.41
    11.36
    11.87
    11.97
    11.67
    11.75
    11.59
    2.27
    樣品2測(cè)定值（ng/ml）
    28.57
    28.62
    28.68
    28.98
    28.87
    28.12
    28.92
    28.53
    28.66
    0.963

    3.0結(jié)論：
     
    此方法簡(jiǎn)便易行，快速準(zhǔn)確，靈敏度高，檢測(cè)限低，適合大批量檢測(cè)，值得推廣
     
     
    4.0參考文獻(xiàn)：
    王若軍,苗朝華,張振雄.中國(guó)飼料及飼料原料受霉菌毒素污染的調(diào)查報(bào)告.<<飼料工業(yè)>>2004.2（21）.:25
    （3）G.. Buttinger, E.Fuchs,H.Knapp,F.Berthiller,2004,Performance of new clean-up column for the determination of ochratoxin A in cereals and foodstuffs by HPLC-FLD.Food Additives and Contaminants,11,1107-1114.
     
     
     

     

     

     

     
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