ELISA克隆試劑盒

1 原理：
ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，受檢標(biāo)本與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。測(cè)定方法具有很高的敏感度（pg-ng/ml水平），并且重復(fù)性好。
ELISA 常用的酶和底物
辣根過氧化物酶，底物為OPD, 深桔 ，檢測(cè)波長(zhǎng)492nm
TMB，藍(lán)綠色，檢測(cè)波長(zhǎng)450nm
堿性磷酸酶，底物為PNPP（對(duì)－消基苯磷酸酯）,
檢測(cè)波長(zhǎng)405nm
ELISA各步驟的反應(yīng)時(shí)間
包被：24－36h，蛋白濃度為1－5ug/ml
封閉：37ºC 2h 或4ºC過夜（3％BSA）
樣本反應(yīng)時(shí)間：37ºC 45min-1h
酶標(biāo)抗體反應(yīng)時(shí)間： 37ºC 45min-1h
顯色時(shí)間：15min（避光）
設(shè)對(duì)照
可以一次包被多塊板，凍存?zhèn)溆?br />2 類型
（1）間接法測(cè)抗體
間接法是檢測(cè)抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體，檢測(cè)與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。
常用于臨床血清中自身抗體的檢測(cè)，以及雜交瘤上清特異性抗體的篩選。如血清中PDCD5自身抗體的檢測(cè)。

（2） 雙抗體夾心法測(cè)抗原
是檢測(cè)抗原zui常用的方法。
只要獲得針對(duì)受檢抗原的特異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。
常用的組合：?jiǎn)慰寺】贵w＋多克隆抗體
單克隆抗體＋單克隆抗體
后一組合是兩種單克隆抗體針對(duì)抗原上不同的相距較遠(yuǎn)的兩個(gè)抗原決定簇，分別用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。
用途：測(cè)定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原，但不適用于測(cè)定半抗原及小分子單價(jià)抗原，因其不能形成兩位點(diǎn)夾心。例如各種細(xì)胞因子的檢測(cè)。

雙抗體夾心法測(cè)抗原的方法：
捕獲抗體包被→封閉（3％BSA）→待測(cè)抗原→洗滌（含0.1％Tween的PBS）→酶標(biāo)單抗或多抗→洗滌→顯色→檢測(cè)
（3）競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原
1）抗體固相測(cè)抗原 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測(cè)定，可以采用競(jìng)爭(zhēng)法模式。
其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，zui后的顯色也愈淺。
 

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